# 주름, 피부장벽 개선 '마이크로바이옴 Exosomal nanovesicles PREX™ LL'

 

1. 서론

프로바이오틱스는 ‘생명을 위한’이라는 뜻의 라틴어로 1965년 Lilly와 Stillwell에 의해 처음 정의됐다¹⁾. 2002년 Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization (FAO/WHO)에서 ‘적절한 양을 취했을 때 숙주에게 이로움을 주는 살아있는 미생물’로 정의했다.

 

프로바이오틱스의 종류로는 대부분 유산균이 차지하고 있으며 가장 많은 부분을 차지하고 있는 락토바실러스 속(Lactobacillus spp.)과 더불어 비피도박테리움 속(Bifidobacterium spp.), 락토코쿠스 속(Lactococcus spp.) 등이 포함된다. 이러한 프로바이오틱스들은 면역력 조절과 아토피, 관절염, 고혈압 개선 등 다양한 효능을 갖는 것으로 보고됐다^2~5). 특히 Lactococcus lactis의 경우 식물 혹은 동물의 위장에 존재하며 항균과 피부 개선 등의 효능이 보고된 바 있다^6~8).

 

피부 개선 효능은 항노화와 피부 장벽기능 개선을 통해 확인할 수 있다. 가장 바깥에 존재하는 표피의 각질 층, 특히 최외각층인 피부 장벽은 보습을 유지하는 기능을 담당한다. 피부 장벽의 정상적인 각질 형성이 중요한데 각질형성세포의 분열과 다양한 분화조절 인자에 영향을 받는다. 피부 장벽은 filaggrin, loricrin 등 여러 유전자와 단백질에 의해 유지되며 이런 구조단백질의 결합으로 인해 단단한 구조인 각질세포막(cornified cell envelop)이 형성된다⁸⁾⁹⁾.

 

한편, 진피가 갖고 있는 콜라겐과 엘라스틴은 피부 구조와 탄력을 유지하고 피부를 보호하는 역할 또한 수행 한다. 하지만 노화가 진행되면 엘라스틴, 콜라겐 그리고 fibrillin의 합성량이 감소하게 되고 피부 구조가 약해 진다. 결국 보호받지 못한 피부는 외부 자외선으로부터 활성산소가 유도되고 여러 신호 전달체계가 활성화되어 수분손실과 탄력감소 등이 진행된다¹⁰⁾¹¹⁾. 이에 따라 피부 노화와 장벽 기능 개선을 위한 소재가 필요하다.

 

엑소좀 유사 나노베지클(nanovesicles)은 나노미터 크기의 소포체로 인지질이중충 막으로 둘러싸여져 있으며 콜로이드 형태이다¹²⁾. 미생물 특히 유산균 유래의 나노베지클은 유용 항균 물질 등을 포함하고 있어 다양한 형태로 연구되고 있으며¹²⁾¹³⁾ 세포 외 소포체(extracellular vesicles, EVs)를 포함하는 말로 세포 내부로부터 유래한다¹⁴⁾. EVs는 50∼200nm 크기이며 DNA, RNA, 지질, 단백질 등 다양한 물질들을 포함하는 것으로 세포막에 의해 둘러 싸여 있다¹⁵⁾. 이 세포 외소포체는 다른 세포에 정보를 전달함으로써 영향을 주는 독특한 효능을 갖고 있으며 질병 진단과 치료제로써큰 관심을 받고 있다¹⁶⁾¹⁷⁾.

 

박테리아 유래 EVs는 1960년대 그람음성균인 Escherichia coli(E. coli)에서 처음 발견됐다¹⁸⁾. 그람양성균의 경우 비교적 최근에 발견 됐으며 유산균 유래 EVs 또한 배양상등액으로부터 분리해 그 특징과 기능들이 밝혀지고 있다¹⁹⁾. 그 예로는 Lactobacillus plantarum(L. plantarum)의 EVs는 항우울과 항아토피²⁰⁾²¹⁾ 효능이, Bifidobacterium longum(B. longum)의 EVs는 음식물 알레르기 개선²²⁾ 효능이, Lactobacillus rhamnosus(L.rhamnosus)의 EVs는 간암세포 증식억제²³⁾ 효능이 있는 것으로 밝혀져 있다. 하지만 유산균 유래 EVs와 관련 연구는 비교적 최근에 이루어지고 있으며 시간 대비 분리 효율이 낮아 분리 방법에 관한 연구가 필요하다.

 

Lactococcus lactis subsp. lactis(LL)의 피부에 대한 연구는 밝혀져 있는 한편, LL 유래 엑소좀 모사 나노베지클과 관련된 연구는 미미한 실정이다. 이에 따라 본연구에서는 생산 효율과 효능의 증가를 위해 한외 여과방법을 이용해 LL 유래 엑소좀 유사 나노베지클(LVs) 을 고농도로 분리하고 그에 대한 특성을 분석했다. 그리고 이로부터 형성된 LVs의 피부에 대한 항노화, 피부 장벽개선 효능을 확인했다.

 

2. 실험 재료 및 방법

2-1. 사용 균주

사용된 유산균은 Korean culture center of microorga nisms(KCCM, Korea)에서 분양 받은 Lactococcus lactis subsp. lactis(KCCM 40104, LL)를 사용했으며 동결 건조된 균주를 MRS broth(Difco, USA)에 접종해 37℃에서 24h 씩 배양 후 다시 계대배양하고 20% glycerol 용액에 현탁하고 -80℃에 보관해 실험에 이용했다.

 

2-2. 발효 배양

LL를 계대배양하고 계대 배양된 유산균을 fermenter(Fermentec, Korea)를 이용해 발효 배양을 했다. 구체적으로 1 L volume의 de Man, Rogosa and Sharpe(MRS ; BD, USA) 배지에 1% (v/v)를 접종하고 30℃에서 24h 배양했다.

 

2-3. 유산균 유래 엑소좀 유사 나노베지클 분리 및 분석

 

수득한 발효물은 물리적인 힘으로 파쇄했고 세포잔 해를 제거한 발효물만 TFF system을 이용해 한외여과 하고 농축했다. 마지막으로 수득된 농축액을 0.2μm membrane filter를 이용해 제균여과해 LL 유래 엑소좀 유사 나노베지클(LVs)을 얻었다. NTA를 통해 나노 입자를 분석한 후 나머지는 동결 건조했으며 이를 효능 평가에 이용했다.

 

2-4. 세포 생장 및 세포 독성 시험

배양된 HDF, HaCaT을 각각 1 × 10⁵ , 5 × 10⁴ cell/ mL의 농도로 96 well plate에 분주하고, 24h 배양했다. LVs를 0.001∼0.02%(v/v)의 농도로 처리한 후 다시 48h 배양했다. 세포 생장과 세포 독성 확인 시험은 cell counting kit-8(CCK-8, Dojindo, USA.)와 cytotoxicity LDH assay kit-WST(Dojindo, USA.)를 이용했으며 제조사의 방법에 따라 시험했다. 구체적으로 세포 배양 후 상등액만을 이용해 LDH solution과 반응시킨 후 490nm에서 흡광도를 측정하고 plate에 남아있는 cell과 CCK-8를 반응시켜 450nm에서 흡광도를 측정했다. 그리고 아래 식에 따라서 세포 생장률 과독성율을 계산했으며 대조군은 lysis buffer이다.

 

 

2-5. 피부 탄력 및 장벽 관련 유전자 발현 측정

LVs가 피부 탄력과 장벽과 관련된 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 섬유아세포에서 fibrillin(FBN1)과 피부각질세포에서 fibronectin(FN1), filaggrin(FLG)의 유전자 발현량을 확인했다. 세포를 24 well plate에 분주하고 24h 배양한 후 시료를 처리하고 48h 추가 배양했다. 시료의 농도는 0.001%(v/v)가 되게 했다. 상등액을 제거하고 TaKaRa MiniBEST Universal RNA extraction kit(TaKaRa, Japan)를 이용해 RNA를 분리했다. 분리한 RNA의 순도를 위해 A260/A280 ratio를 측정했으며 260nm 측정값을 이용해 RNA를 정량했다.

 

cDNA 합성을 위해 정량한 RNA와 amfiRivert cDNA synthesis platinum master mix(GenDEPOT, USA)를 섞어 사용한다. 60℃에서 1min 간 RNA denaturation, 25℃에서 5min 간 annealing, 42℃ 에서 60min 간 extend, 85℃에서 1min 간 reverse transcriptase inactivation시켰다. 그리고 합성된 cDNA를 증폭하기 위해 cDNA, primer 그리고 LightCycler^® 480 SYBR Green I Master Mix(Roche, Swiss)를 섞었고 LightCycler^® 480 System을 이용해 qRT-PCR을 진행했다. 각 primer 서열은 표1과 같다.

 

표1 Forward and Reverse Primer PCR Sequence for qRT-PCR

 

 

2-6. Enzyme Linked Immunosorbent assay (ELISA)를 이용한 콜라겐 단백질 생성 측정

LVs의 콜라겐 단백질 생성 측정을 위해 광노화된 피부각질세포에 LVs를 처리하고 콜라겐(collagen type I alpha 1, COL1A1) 생성 변화를 확인했다. 세포를 24 well plate에 분주하고 24h 배양한 후 시료를 처리한 후 48h 배양한다. 시료의 농도는 제일 낮은 농도인 0.001%(v/v)로 했다. 그 후 배양배지를 DPBS(Capricorn, Germany)로 교체하고 UVB 5mJ/cm²을 조사한 후 배양 배지에서 24h 추가 배양했다.

 

비교를 위해 UV 조사 군과 비조사군으로 나누어 실험을 진행했으며 시료 처리 후 72h 배양했다. 그리고 상등액만을 취하고 효소면역측정법(ELISA)를 이용해 발현량을 측정했다. ELISA는 human pro-collagen I alpha 1 DuoSet ELISA(R&D Systems, USA)를 이용 했으며 실험방법은 제조사의 방법에 따랐다. 대조군은 시료를 처리하지 않은 군이다.

 

2-7. Cornified Envelop(CE) 단백질 형성 확인

LVs의 각질형성능을 측정하기 위해 cornified envelope assay를 수행했다. HaCaT 세포를 6 well plate에 분주하고 24h 동안 배양해 세포가 100% 밀집 상태가 되게 했다. 0.001%(v/v)의 시료를 처리한 후 6일 간 배양했고 시료는 3일 마다 재처리 했다. 6일 후 DPBS를 이용해 세포를 세척하고 2% SDS solution을 150µL씩 처리했다. 5min 간 ice에서 반응시킨 후 세포들을 1.5mL tube에 scraper로 수득하고 5s 간 초음파 파쇄했다.

 

그리고 BCA protein assay kit(iNtRON biotechnology, Korea)를 이용해 단백질을 정량 했다. 나머지는 13,000rpm, 20min 조건 아래 원심분리 하고 상등액을 제거했다. Pellet에 20mM DTT in 2% SDS solution을 100µL씩 각각 첨가하고 90℃에서 20min 동안 끓여 주었다. 그리고 이를 96 well plate에 옮긴 후 spectrophotometer를 이용해 310nm에서 흡광도를 측정했다. 양성대조군으로는 Ca²⁺ 을 처리한 것으로 했다.

 

2-8. 통계 분석

본 실험에서는 3회 반복 실험을 진행해 결과를 평균 값으로 나타냈다. 통계적 유의성은 student’s t-test를 사용해 p < 0.05의 신뢰수준에서 검증했다( ^* p < 0.05, ^** p< 0.01, ^*** p < 0.001).

 

3. 결과 및 고찰

3-1. 유산균 유래 나노베지클 특성 분석

NTA 방식으로 나노 입자를 측정했고 분석은 NS300 소프트웨어를 통해 자동 분석했다. 분석한 결과, 70∼ 200nm 크기로 최빈값은 115nm 인 것으로 나타났다. 입자 수는 1.81 x 1011 particles/mL로 나타났다(그림1, 표2).

 

그림1 Characterization of exosomal nanovesicles isolated from Lactococcus lactis subsp. lactis (LL) (A) Representative graph shows particle concentration and their size measurements. (B) The scattering distributions are presented from three consecutive 30 s runs for nanoparticles.

 

 

표2 Results of Nanoparticle Tracking Analysis

 

 

3-2. 세포 생장 및 독성 측정

LVs의 안전성을 확인하기 위해 세포 생장과 세포 독성 시험을 진행했다. 먼저 CCK-8을 이용한 세포 생장 측정을 진행했을 때 LVs 실험 농도 모두 세포 증식을 확인했다. HaCaT과 HDF 세포에서 세 농도 모두 심각한 세포 성장 억제능을 보이지 않았으며 특히 HaCaT 세포에 고농도를 처리했을 때는 20% 이상의 증식률을 보여주었다. 세포 독성 시험(LDH assay) 결과, 실험 농도 모두 세포 독성이 없음을 확인했다. 이로 LVs를 이용한 실험에서 세포 생장 억제와 독성에 의한 영향은 없으며 화장품 등에 이용할 수 있는 안전한 원료임을 확인했다(그림2, 3).

 

그림2 Effect of LVs on the cell viability. (A) HaCaT, (B) HDF. (-) ; non-treated, lysis; lysis buffer treated, LVs; LVs treated. The results are expressed as the mean ± SD (N = 3). ^*** p < 0.001 compared with non-treated.

 

 

그림3 Effect of LVs on the cell cytotoxicity. (A) HaCaT, (B) HDF. (-) ; non-treated, lysis; lysis buffer treated. LVs; LVs treated. The results are expressed as the mean ± SD (N = 3).

^*** p < 0.001 compared with non-treated.

 

 

3-3. 유전자 발현량 확인

 

3-3-1. FBN1 유전자 발현 증가 효능

Fibrillin(FBN1)은 collagen type I alpha 1(COL1A1), fibronectin(FN1)과 함께 세포 외 기질의 중요한 구성 요소이며 탄력섬유로써 피부 탄력과 보습 인자로 많이 알려져 있다^{24, 25)}. 따라서 FBN1 유전자 발현 확인을 통해 LVs의 피부 탄력에 관한 효능을 평가했다. 섬유아세포에 LVs를 처리했을 때 FBN1 유전자 발현은 그림4와 같다. 유전자 발현이 대조군 대비 약 23% 증가함을 확인했다. 이에 따라 LVs는 피부 자극 없이 탄력 회복하는 것에 도움이 될 것으로 생각된다.

 

그림4 Effect of LVs on fibrillin (FBN1) gene expression. (A) mRNA expressions of FBN1 were measured by qRT-PCR, (B) RT-PCR for FBN1 mRNA. (-); non-treated, LVs; LVs treated (0.001%). The results are expressed as the mean ± SD (N = 3). ^*** p < 0.001 compared with non-treated.

 

 

3-3-2. FN1, FLG 유전자 발현 증가 효능

FN1은 세포외 기질의 당단백질로 피부 구조 유지에 중요해 상처치유와 장벽 개선, 주름 예방에 매우 중요한 역할을 하고 있다^26~28). Filaggrin(FLG)은 FN1과 마찬가지로 장벽에 중요한 역할을 하며, FLG 결핍은 천연보습인자(natural moisturizing factors, NMF)가 감소되고 아토피 피부염을 유발한다고 밝혀져 있다²⁹⁾³⁰⁾. 이에 따라 피부세포에 LVs를 처리해 FN1과 FLG 유전자 발현에 미치는 영향을 확인해 피부 장벽에 관한 효능을 평가했다. 그림5와 같이 LVs을 처리함에 따라 대조군 대비 FN1 유전자는 약 65%, FLG은 400% 이상 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 LVs는 FN1 발현을 증가시켜 장벽과 주름 개선에 도움을 줄 것으로 생각한다.

 

3-4. 피부 세포에서 콜라겐 단백질 생성량 증가 확인

Type I collagen은 type Ⅲ와 함께 피부 표피 구조를 지지해 주는 주요한 콜라겐이며 피부 항노화와 탄력인자로 널리 알려져 있다³¹⁾. 특히 자연 노화 혹은 자외선에 의한 광노화 때문에 피부의 콜라겐이 분해되어 주름이 생성된다. 이에 따라 광노화 된 피부각질세포와 일반 피부각질세포에서 콜라겐 생성에 미치는 영향을 확인할 수 있다³²⁾³³⁾. LVs가 콜라겐 생성에 미치는 영향은 그림6에서 확인할 수 있다. UV 비 조사군에서는 45%, UV 조사 군에서는 83%로 현저하게 증가함을 보여주었다. 따라서 LVs는 피부 탄력과 항노화에 도움을 줄것으로 생각되며 특히 자외선에 의한 광노화를 개선시킬 것으로 판단된다.

 

그림5 Effect of LVs on fibronectin (FN1) and filaggrin (FLG) gene expression. (A) mRNA expressions of FN1 and FLG were measured by qRT-PCR, (B) RT-PCR for FBN1 and FLG mRNA. (-); non-treated, LVs ; LVs treated (0.001%). The results are expressed as the mean ± SD (N = 3).

^*** p < 0.001 compared with non-treated.

 

 

그림6 Effect of LVs on collagen type 1 (COL1A1) expression. (-) ; non-treated, LVs; LVs treated (0.001%). The results are expressed as the mean ± SD (N = 3). ^*** p < 0.001 compared with non-treated.

 

 

3-5. Cornified Envelop 형성능 확인

피부각질세포는 피부장벽 기능에 중요한 역할을 하며 피부 기저층에서 부터 각질층까지 분화가 이루어지게 되어있다³⁴⁾. 분화 마지막 과정에서 Ca 2+ 농도가 높아지면 loricrin, filaggrin(FLG)과 같은 인자들의 분화가 유도된다. 여기서 FLG은 피부의 탄탄한 장벽인 cornified envelop(CE) 형성에 중요한 역할을 한다³⁰⁾. 피부각질세포의 분화 능을 확인하기 위해 CE 형성능 확인 시험을 진행했다. LVs의 처리함 따라 약 30% 증가되는 것을 확인했으며 CE 형성능을 확인할 수 있었다(그림7). 따라서 LVs가 피부장벽 개선에 도움을 줄수 있을 것으로 생각된다.

 

그림7 Effect of LVs on cornified envelop (CE) formation.(-) ; non-treated, Ca 2+ ; Ca 2+ treated, LVs; LVs treated (0.001%). The results are expressed as the mean ± SD (N = 3).

^*** p < 0.001 compared with non-treated.

 

 

4. 결론

유산균은 장 건강을 포함해 면역력을 개선하고 다양한 질병 예방의 효능이 알려지면서 큰 관심을 받고 있다. 또 피부상태 개선에 대한 효능이 알려지면서 화장품 소재로 널리 쓰이고 있다³⁵⁾³⁶⁾. 이에 반해 사균, 여과물과 용해물을 끝으로 종류에 한계에 부딪혀 있는 것이 현실이다. 엑소좀 또한 유산균과 더불어 여러 효능이 밝혀지면서 최근 큰 주목을 받고 있다.

 

본 연구에서도 유산균 유래 엑소좀 유사 나노베지클을 이용해 피부에 대한 효능을 확인했지만 아직 많은 연구가 이루어지지 않아 밝혀야 할 부분들이 더 많다. 따라서 지속적인 연구를 통해서 엑소좀 유사 나노베지클의 특성, 분석과 관련된 연구가 요구된다.

 

본 연구에서는 유산균 중 Lactococcus lactis subsp. lactis 유래 엑소좀 유사 나노베지클을 대상으로 하여 연구를 진행했다. 먼저 엑소좀 유사 나노베지클을 분리하고 NTA를 통해 그 특성을 확인했다. 피부 장벽과 관련된 FN1, FLG 유전자 발현량을 확인했을 때 LVs가 발현량을 현저하게 증가시켰고 피부각질세포의 분화를 촉진해 피부 각질형성능이 증가했다.

 

이는 피부장벽을 이루고 있는 단백질과 그에 대한 유전자 발현을 증가시켜 손상된 피부의 기능 회복에 도움을 줄 것으로 판단된다. 그리고 노화와 관련된 FBN1 유전자 발현과 콜라겐 생성량이 LVs 처리에 의해 현저하게 증가한 것을 알 수 있었다. 이로 인해 노화로 감소한 탄력과 주름개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

 

결론적으로 유산균 유래 엑소좀 유사 나노베지클은 피부 상태 개선을 위한 신규 원료로써 화장품 혹은 코스메슈티컬 분야에 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

 

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